ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ СТАБИЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР НА ХРАНЕНИЕ СПОР SALVINIA NATANS

Министерство просвещения Российской Федерации федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский педагогический государственный университет» Институт биологии и химии

Заведующий кафедрой ботаники д.б.н., профессор Викторов В.П

Проверка на объем заимствований:

_______% авторского текста

Москва – 2022 год

ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия многие отчеты указывают на сокращение популяций представителей класса Polypodiopsida (Папоротниковые). Папоротники не имеют большого экономического значения, но имеют коммерческий потенциал и экологические ресурсы. Некоторые выращиваются или собираются в пищу, используются как декоративные растений, так и для фиторемедиации.

Сокращение популяций папоротников может быть связано с уязвимостью их среды обитания. Репродуктивная система споровых растений строго привязана к воде, что придает им большую чувствительность к изменениям окружающей среды. Активное влияние антропогенной нагрузки на естественные биоценозы приводит к снижению числа особей и количества популяций, нарушению естественного возобновления видов, в том числе и среди папоротниковидных.

Среди всего разнообразия папоротниковидных особое место занимают разноспоровые, а среди последних – однолетний водный папоротник сальвиния плавающая Salvinia natans (L.) All.(Salviniaceae).Сальвиния плавающая – важное звено водных экосистем, которые, несомненно, подвергаются сильному антропогенному прессу. Знакомство с научной литературой дает немало примеров слабой изученности этого вида (Н.С. Барабанщикова, 2021; М.А. Али-Эльдин, 2012; A. Galka,2012 и др.). В частности, наблюдается крайне малое количество работ по исследованию жизнеспособности спор папоротников из рода Salvinia.

В Московской области Salvinia natans находится на северной границе своего ареала и включена в Красную книгу Московской области, в связи с чем возникает потребность в сохранении вида (Щербаков, 2008). В Астраханской области Salvinia natans встречается в  водотоках и водоемах с медленным течением очень часто, создавая местами сплошной покров на поверхности воды (Лактионов, 2020). Однако, логично предположить, что изучение способов сохранения того или иного вида следует начинать не тогда, когда вид уже находится на грани исчезновения, а намного раньше.

Наиболее эффективным и действенным механизмом сохранения является защита местообитаний, но также признано, что методы сохранения ex-situ (в искусственных условиях, в условиях культуры) являются важнейшими компонентами глобальной программы сохранения видов живых существ. В отличие от in-situ (сохранения видов в местах их естественного проживания), ex-situ – это стратегия сохранения видов, при которой ресурсы генофонда тех или иных видов содержатся в искусственных условиях (семена, пыльца, сперма, замороженные клетки, отдельные организмы в ботанических садах и зоопарках). Эти ресурсы изымаются из природной среды и в качестве компонентов биоразнообразия содержатся отдельно от своего исконного местообитания. Данный метод сохранения подразумевает, что отбор проб, перемещение, хранение и воспроизведение осуществляется за пределами естественной среды обитания организмов.

Виды растений, собранные непосредственно из естественных природных биоценозов, более требовательны к условиям воспроизведения, чем культурные виды. Таким образом, важен поиск оптимальных условий и технологий для сохранения растений природной флоры ex-situ.

В работе представлены результаты эксперимента по поиску оптимальных условий хранения спор Salvinia natans из трех вариантов стабильных температурных режимов и двух вариантов режимов влажности.

Кроме того, интерес к Salvinia natans вызван тем, что данное растение  —удобный модельный объект для исследования многих процессов (в экологии, биотехнологии) в общеобразовательной школе, доступно для изучения без применения специальных приборов, имеет довольно крупные размеры.

Исходя из вышесказанного, мы можем утверждать, что тема исследования значима и актуальна, так как существует противоречие между недостаточным уровнем изученности оптимальных условий зимовки Salvinia natans, а практический аспект проделанных исследований заключается в разработке методики исследования влияния стабильных температур на хранение спор.

Целью данного исследования стало изучение влияния стабильных экспериментальных условий хранения спор Salvinia natans (L.) All. на сроки и качество их прорастания.

Объект исследования: споры папоротника Salvinia natans (L.) All.

Предмет исследования: особенности влияния стабильных температур на хранение спор Salvinia natans (L.) All. и последующее их воспроизведение.

Гипотеза: на хранение спор Salvinia natans (L.) All. и последующее их воспроизведение будут влиять стабильные температуры, близкие к естественным.

Исходя из темы, цели и гипотезы, были сформулированы следующие задачи:

1. Определить характер и степень влияния стабильных температур в сочетании с другими абиотическими факторами на успешность зимовки спор Salvinia natans.

2. Оценить воздействие экспериментальных условий зимовки споровой продукции Salvinia natans на развитие нового поколения спорофитов, используя динамику онтогенетического спектра.

3. Разработать методическую главу по использованию Salvinia natans в качестве биологического объекта в лабораторных работах для общеобразовательных учреждений, с дальнейшим применением при отработке заданий из единого государственного экзамена.

Методы исследования: экспериментальный, наблюдение, сравнение, онтогенетический.

Методологическая основа: в основу данной работы положены исследования в области биологии Salvinia natans (Н.С. Барабанщикова, М.А, Али-Эндин, и др.), а также работы исследователей в области методики преподавания биологии в школе (Н.М. Верзилин, И.Н. Пономарева, и др.).

Научная новизна данной работы заключается в поиске оптимальных условий для хранения ex-situ спор Salvinia natans.

Структура работы: данная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы, приложения.

В работе представлены результаты прорастания спор Salvinia natans находящихся в разных условиях хранения со стабильными температурами.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ВОЗДЕЙСТВИЯ СТАБИЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР НА ХРАНЕНИЕ СПОР SALVINIA NATANS

1.1. Влияние абиотических условий на хранение и воспроизведение спор Salvinia natans

Сальвиния плавающая (Salvinia natans) — объект изученияжизнеспособности спор для создания их искусственного банка. Salvinia natans как водный папоротник – важное звено водных экосистем. Кроме того, интерес к Salvinia natans вызван тем, что данное растение удобный модельный объект для исследования многих процессов (в экологии, биотехнологии). Растение доступно к изучению, так как встречается в регионе исследования, не требует применения специальных сложных методов, а также имеет довольно крупные размеры.

При данных параметрах работу с Salvinia natans можно организовать в любых лабораторных условиях, не требующих дорогостоящего оборудования.

Основным достоинством, позволяющим использовать Salvinia natans в опытно-экспериментальной работе, является минимальная материально-техническая база для исследования и доступность модельного организма в природной среде.

Для обоснования необходимости применения Salvinia natans в качестве модельного организма в школьной программе, приведем ряд факторов:

Salvinia natans – растение, обитающее в природных условияхв водоемах региона исследования;

Salvinia natans школьники могут самостоятельно обнаружить в водоемах;

— в условиях лаборатории доступно исследование всхожести спор Salvinia natans в различных температурных условиях. Исследование Salvinia natans в условиях лаборатории не требует специальных знаний, однако целесообразно провести изучение вопроса всхожести спор Salvinia natans;

— исследование спор Salvinia natans в условиях лаборатории не требует дорогостоящего оборудования, материалов и реагентов.

Исследование воздействия стабильных температур на хранение спор Salvinia natans необходимо, прежде всего, для изучения возможности создания банка спор, а также для решения прикладных задач [1]

По мнению исследователей [5] хранение целесообразно производить в течение относительно долгого периода времени (не менее 4 месяцев), так как необходимо выявление необходимости стратификации спор S. natans, а также изучение влияние различных температур в течение длительного времени.

Н.С. Барабанщикова и Ф.А. Орлюк указывают, что исследование жизнеспособности спор S. natans целесообразно изучать с позиции ряда факторов: свет, влага, термический режим.

Освещение – это количество солнечной радиации, поступающее на единицу площади. Освещение может быть естественным и искусственным. В рамках данного исследования будет рассматриваться всхожесть спор в условиях естественного освещения.

Обводненность – это характеристика, показывающая, какое количество влаги содержится в среде. В рамках данного исследования будет изучено хранение спор в условиях различной обводненности (в воде и в высушеннос состоянии).

Основным параметром исследования будет температура, так как экспериментальная работа будет строиться на исследовании хранения спор с последующей всхожестью в зависимости от действия определённой температуры.

По нашему мнению, детерминирующим будет гидротермический режим хранения спор S. natans, однако для полноты данных необходимо исследовать влияние света на всхожесть спор S. natans.

Для исследования оптимально применять различное сочетание факторов. Основными переменными были: температура, обводненность, освещенность. Данные факторы сочетались в различных вариантах, что позволяло моделировать условия в природной среде, в пределах которой происходит зимовка спор S. natans и формирование почвенного банка спор (табл. 1.1).

Таблица 1.1 – Сочетание абиотические факторов среды, влияющих на прорастание спор S. natans (по Н.С. Барабанщиковой)

Сочетание факторов Температура Обводненность Свет
1 вариант -18 Влажно Темно
2 вариант -18 Сухо Темно
3 вариант +5 Влажно Темно
4 вариант +5 Сухо Темно
5 вариант Комнатная температура Сухо Свет
6 вариант Комнатная температура Влажно Темно
7 вариант Комнатная температура Сухо Темно
8 вариант Комнатная температура Влажно Свет

Как видно из таблицы 1.1, общее количество сочетания абиотических факторов достаточно для исследования влияния стабильной температуры на всхожесть спор S. natans.

Следует отметить, что хранение спор в различных гидротермических условиях с последующим воспроизведением exsitu целесообразно проводить, начиная с осеннего сезона, что оптимально для моделирования естественных условий. Также это связано с чередованием сезонов, и отправной точной эксперимента является завершение периода вегетации у S. natans.

Климат средней полосы, оптимальный для воспроизведения S. natans, имеет четко выраженный холодный период, предусматривающий промерзание мелководных водоемов, что также необходимо учитывать при подготовке эксперимента [32]

Особенностью климата средней полосы России является его умеренность, то есть оптимальное сочетание температуры и влажности по сезонам для зимовки спор S. natans. Климатические особенности региона исследования следующие:

1) тип климата – умеренно-континентальный. Четко прослеживается сезонность. Лето тёплое, зима умеренно холодная. По направлению на восток и северо-восток области континентальность климата нарастает, что выражается в увеличении среднегодовой амплитуды температур и понижении относительной влажности.

2) зимний период составляет 120 – 135 дней, характеризуется отрицательными температурами. Данный период наиболее важен для хранения спор в почвенных банках. Начало холодного периода начинается в ноябре и длятся по март, когда сумма биологически-активных температур нарастает пропорционально инсоляции. Среднегодовая температура воздуха в регионе исследования составляет 3,5 до 5,8 °C. Минимальные показатели января – минус 12°C.

Для формирования почвенного банка спор важным условием является формирование снежного покрова. Климатическая норма формирования снежного покрова для региона исследования составляет ноябрь-месяц. Изредка зимы бывают бесснежные, что сказывается на сохранности и прорастании спор водных папоротников в теплое время года. При установлении снежного покрова отмечается климатическая норма 25 – 50 см, что достаточно для эффективной зимовки спор. Снежный покров сохраняется по апрель включительно и совпадает с началом прорастания спор.

Следует отметить, что в зимний период происходит промерзание верхнего слоя грунта до 75 см.

Эти климатические особенности Центральной России необходимо учитывать при моделировании условий хранения спор S. natans с их последующим прорастанием. Также это необходимо учитывать при формировании почвенного банка спор, так как промерзание грунта может негативно сказаться на всхожесть спор S. natans.

Для территории исследования максимальные температуры зафиксированы в июле (средняя температура +18 °C на северо-западе и +21 °C на юго-востоке). Летние температуры влияют на вегетацию S. natans и эффективность спорообразования.

Количество осадков обычно составляет 500 – 700 мм в год и непосредственным образом влияет на обводненность территории. Данные показатели необходимо учитывать и по месяцам, так как всхожесть спор S. natans непосредственным образом зависит от обводненности территории и количестве влаги в водоеме, в котором происходит прорастание спор и формирование спорофита. Также обводненность влияет на качество формирования гаметофита, оплодотворения и последующего онтогенеза S. natans.

Летом обычно в среднем выпадает 75 мм осадков в месяц, однако раз в 25 – 30 лет в Московской области случаются сильные засухи, когда осадков летом может практически не выпадать. При довольно высоких летних температурах и малой обводненности споры могут не прорастать и, соответственно, возникнут проблемы с последующим хранением и формированием почвенного банка спор.

Следует отметить, что S. natans имеет широкий адаптационный диапазон к изменению гидротермического режима, что проявляется в относительной обширности ареала [32] и пластичности к изменению абиотических факторов среды обитания. Данная пластичность обусловливает широкий диапазон условий произрастания S. natans, однако экстремальные значения абиотических факторов среды могут стать ограничивающими для воспроизведения спор и последующего формирования гаметофитов и спорофитов.

Прорастание спор папоротников, в том числе S. natans, представляет собой сложный процесс, детерминированный влиянием как биотических, так и абиотических факторов среды: одно сочетание факторов стимулирует прорастание спор (например, умеренная температура и высокая влажность), а сочетание неблагоприятных факторов напротив, ингибирует данный процесс. Следует отметить, что споры S. natans содержат хлорофилл, что делает зависимым прорастания от солнечного света.

То есть, при моделировании условий прорастания спор папоротника S. natans необходимо понимать значение продолжительности светового дня и интенсивность солнечной радиации.

Важным абиотическим фактором среды, влияющим на оптимальную сохранность и прорастание спор S. natans, является кислотность субстрата, в данном случае, водоема, в пределах которого обитает растение. Кислотность субстрата определяется аэрацией водоема, твердым стоком с суши (определяет содержание анионов и катионов в воде), а также уровнем воды в водоеме, так как понижение уровня воды приводит к повышению концентрации веществ и ухудшению аэрации. Кроме того, необходимо учитывать геохимию территории и особенности стока и миграции элементов. Данные факторы необходимо учитывать для анализа химического состава воды водоема произрастания папоротника, а также при моделировании условий exsitu.

Прорастание спор S. natans exsitu находится под контролем различных средовых факторов, включая температуру, инсоляцию, pH среды, газовый состав и различные химические соединения [31].

Довольно часто сочетание данных факторов бывает видоспецифичным, однако существуют основные требования, которые имеют отношение к хранению спор S. natans и последующему их прорастанию exsitu.

Для оптимального прорастания необходимы стабильно высокие температуры, хотя для спор ряда папоротников, например, Оphioglossum engelmann необходима обязательная стратификация с чередованием теплых и холодных условий [31].

Для прорастания споры S. natans нуждаются в освещении, причем на их прорастание влияют продолжительность, интенсивность и спектральный состав света. Данный факт более значим для прорастания спор invitro, так как для нашего исследования будет применяться естественное освещение при проращивании спор.

Довольно часто папоротники, которые имеют фотосинтезирующие гаметофиты, нуждаются в интенсивном, продолжительном освещении для прорастания спор и не прорастают в темноте  [31]. Для многих видов свет в красной области является оптимальным, тогда как дальний красный и синий подавляют прорастание спор (там же).

Влияние параметров освещения на прорастание спор может изменяться даже для одного вида в зависимости от освещения во время образования спор. Также всхожесть спор зависит от места и времени сбора спор и условий их хранения [31]. На молекулярном уровне эффекты освещения зависят от фоторецепторов (фитохром и криптохром), присутствующих в спорах, под контролем которых находится первый клеточный митоз споры  [42].

Для большинства видов оптимальные значения pH среды для прорастания спор находятся в слабокислом и нейтральном диапазоне, что соответствует геохимическим особенностям территории Московской области.

Обычно споры прорастают в указанных условиях при соблюдении определенных факторов окружающей среды: обводненность, освещенность, температура. По данным Pinto, растениям достаточно собственных эндогенных гормонов [25]. Тем не менее известно, что фитогормоны и регуляторы роста оказывают влияние на прорастание спор. Например, гиббереллиновая кислота способна обращать ингибирующее действие темноты у некоторых видов и вызывать прорастание спор [31,42]

Среди других факторов, способных влиять на прорастание спор в условиях exsitu, называют плотность спор на поверхности субстрата, или среды. Как высокая, так и низкая плотность содержания спор в среде, могут негативно влиять на прорастание спор.

Исследования показывают, что споры папоротников в экспериментальных условиях прорастают с разной скоростью. В зависимости от заданных условий [41]. Тем не менее, наиболее важное значение для создания банка спор имеют исследования, направленные на экспериментальное сохранение спор в состоянии покоя с их последующим прорастанием.

Например, описаны случаи прорастания спор Pellea sp. после 50 лет хранения в гербарии [39]. Данная информация важна для понимания условий хранения спор с последующим воспроизведением ex-situ, в том числе, и водных папоротников, таких, как S. natans.

Е.М. Арнаутова отмечает, что папоротники, обитающие как в аридных, так и гумидных условиях, имеют высокую жизнеспособность спор, что говорит о высокой приспособленности воспроизведения данных таксонов к среде обитания, в пределах которой они произрастают.

Исследования [37] показывают, что оптимальное прорастания спор, которые содержат хлоропласты (в том числе S. natans), происходит в условиях стабильно низких температур и стабильной влажности. Следует отметить, что споры, содержащие хлоропласты, наиболее уязвимы для абиотических факторов среды, и довольно быстро теряют всхожесть.

Н.С. Барабанщикова и Ф.А. Орлюк отмечают, что такие споры сохраняют всхожесть в течение 1–2 месяцев при высушивании и их последующем хранении при температуре +3…+5 °С. Данные показатели наиболее интересны для нашего исследования, так как гидротермические условия, а также сроки хранения спор подходят для реализации экспериментального исследования воздействия стабильных температур на хранение спор Salvinia natans и последующее воспроизведение ex-situ в условиях школьной биологической лаборатории.

Ряд исследований, касающихся прорастания спор S. natans, показывают, что сроки появления новых особей варьируют от климатических особенностей территории распространения: температура, уровень воды, осадки. Так, A. Gałka, J. Szmeja (2013) указывают, что при изучении прорастания спорангиев S. natans отмечены температуры 12,4 ± 0,2 °С. Причем, появление новых особей варьировало с апреля по сентябрь, что говорит о прорастании спорангиев, зимовавших на суши, и попавших в водоем при повышении уровня воды в результате половодья, либо с атмосферными осадками.

Таким образом, можно сделать вывод, что прорастание спор S. natans может происходить в любой момент времени при определенном сочетании абиотических факторов среды и не зависит от времени года. Тем не менее, для прорастания спор необходим период покоя с их промерзанием и стратификацией. Эти данные необходимо учитывать при планировании экспериментальной деятельности с учащимися, так как ошибка при сборе сорусов, их хранении, некорректных условиях зимовки и прорастания, не позволят получить гаметофиты S. natans в условиях лаборатории.

В данной работе вопрос сохранения спор Salvinia natans в условиях стабильных температур и последующее воспроизведение exsitu будет рассматриваться с позиции моделирования в лаборатории:

— минимальное сочетание абиотических факторов (влажность – температура – свет);

— наглядность процесса (сбор сорусов, хранение спор, закладка объектов на хранение, проращивание спор и получение гаметофитов и, возможно, спорофитов).

— простота подсчета и статистической обработки полученных данных.

1.2. Воспроизведение и хранение спор методом ex-situ

При исследовании воздействия стабильных температур необходимо учитывать, что воспроизведение особей S. natans осуществляется exsitu.

Данный фактор может существенно влиять на время и скорость прорастания спор, так как экспериментальные условия хранения спор отличаются от естественных, что сказывается на их сохранении и последующем воспроизведении гаметофитов.

Ex-situ — это метод защиты исчезающих видов растений, осуществляемый за пределами их естественной среды обитания. При данном методе сохранения производится удаление части популяции из угрожаемой среды обитания и размещения ее в новом месте, искусственной среде (например в лаборатории), с имитацией естественных условий среды обитания соответствующего вида.  Сохранение exsitu может выполнять широкий спектр целей и ролей:

 1) Сохранение репрезентативной выборки из генетического материала вида, т.е. резервная копия зародышевой плазмы;

2) Играют важную образовательную и демонстрационную роль;

 3) Предлагают альтернативу коммерческим сбор урожая из естественных популяций;

4) Полученные данным путем особи могут быть использованы для восстановления или обогащения диких исходные популяции;

5) Представляют долгосрочные запасы генов и сохраняют функциональные признаки для последующего воспроизведения.

Ex situ методы включают широкий спектр методов в зависимости от исходного материала, интенсивности техническое обслуживание и финансовых возможностей, например криоконсервация (споры хранятся в жидком азоте), культура тканей (хранение или размножение), полевые генные банки, живая коллекция, запасы ДНК и банк спор.

Криоконсервация – это способ хранения спор, при котором происходит их замораживание в жидком азоте при температуре –196 °C.

Криоконсервация спор папоротников является эффективным способом их хранения в искусственных условиях продолжительное время. В связи с быстрой потерей жизнеспособности спор папоротников [4] актуальна задача разработки способа криоконсервации спор для их длительного хранения. При этом Е.М. Арнаутова уточняет, что важной задачей способа криоконсервации спор является сохранение их всхожести на уровне, приближенному к оптимальному.

Установлено, что при криоконсервации в жидком азоте споры сохранялись до 6,25 лет [38].

Такой способ сохранения спор способствует их длительному сохранению и последующей всхожести. Данных о долговременном хранении спор папоротников умеренной зоны немного[14]. Экспериментальные данные говорят о неоднозначной реакции спор на замораживание в жидком азоте. По данным И.А. Крещенок и С.В. Нестеровой в ряде случаев наблюдалось снижение всхожести спор папоротников после периода криохранения.

По данным И.А. Крещенок и С.В. Нестеровой, исследовавших криохранение спор папоротников Asplenium и Coptidipteris, Dryopteris sihotensis, D. crassirhizoma, и др., споры по-разному реагируют на замораживание при температуре кипения азота (–196 °C). Всхожесть размороженного материала может сохраняться без изменений, повышаться или снижаться. Криоконсервация не вызывает полной гибели спор. Несмотря на некоторое снижение всхожести, в отдельных случаях более 50 %, споры разных видов папоротников сохраняют способность к прорастанию [14]. Исследования показывают, что криоконсервация спор папоротников может рассматриваться как один из эффективных и перспективных методов долговременного хранения генетического материала папоротников.

Однако такой способ хранения, как криоконсервация спор не является оптимальным, так как для этого необходимо специальное лабораторное оборудование и реагенты (жидкий азот), что часто является недоступным в исследовательских лабораториях.

Одним из последующих способов хранения спор ex-situ является использование культур тканей. Культура тканей в основном используется для клонального размножения вегетативной ткани. Это позволяет размножать клональные растения из относительно небольшого количества материнской ткани. Это эффективный метод, который позволяет хранить зародышевую плазму в течение многих лет. Культура искусственных тканей объединяет множество методов, используемых для поддержания или выращивания растительных клеток, тканей или органов. Культура ткани папоротника использовалась в качестве исследовательского инструмента для изучения возможностей развития зачатков листьев с начала 1950-х годов [33]

Следующий способ сохранения видов папоротников является банк спор. Это место, где хранятся спор для поддержания генетического разнообразия в будущем. В естественных условиях большое количество спор папоротников, осажденных на землю после рассеивания, может немедленно прорасти в благоприятной среде обитания или может образовать почвенный банк спор, которые остаются жизнеспособными в течение нескольких лет. Благодаря этому может произойти создание и восстановление популяций папоротников, и повторная колонизация видов на новых участках. Споры папоротника в почве являются источником будущих гамет. Прорастание спор может происходить когда нарушение почвы сочетается с подходящими абиотическими факторами (температура, свет и влажность). Это является особо значимым, когда благоприятные условия для прорастания возникают нерегулярно в течение года или не совпадают с временем распространения спор. Почвенные банки служат одним из способов выживания вида при условиях, когда спорофиты периодически удалятся вместе с другой растительностью из-за пожаров, засух, оползней и наводнений. Известно образования банка спор на коре деревьев [40]. Данный природный способ сохранения имеет огромный потенциал для экологического сохранения видов.

Постоянный банк спор как способ воспроизведения ex-situ подразумевает под собой хранилища, защищенные от негативных внешних антропогенных и абиогенных условий (от наводнений, бомб и радиации и т.д), в которых хранятся банки со спорами разных видов растений. Хранение спор папоротников получило мало внимания научных деятелей. Исследования по созданию банка спор, как аналога банка семян, в основной массе проводятся для наземных папоротников [39]. C. Prada указывает, что необходимы дополнительные исследования физиологии хранения спор папоротника, чтобы сопоставить и сравнить различные реакции разнообразной зародышевой плазмы растений на различные условия хранения.

Для создания банка спор водного папоротника Salvinia natans необходимо учитывать определенные гидротермические условия хранения, так как водные виды могут предъявлять иные требования к хранению спор, чем наземные.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования

Объектом исследования послужили споры разноспорового водного папоротника вида Salvinia natans из семейства Salviniaceae.

Систематическое положение представлено в табл. 2.1.

Таблица 2.1 – Систематическое положение Salvinia natans

Надцарство Eukaryota (Эукариоты) Chatton, 1925, 1937/1938, Chadefaud, 1960
Царство Plantae (Растения) Haeckel, 1866
Тип/Отдел Tracheophyta (Сосудистые растения) Sinnott, 1935
Тип/Отдел Pteridophyta (Папоротниковидные, папоротники) Haeckel, 1866
Класс Polypodiopsida (Полиподиопсиды) Cronquist, Takht. & Zimmerm.
Отряд/Порядок Salviniales (Сальвиниевые) Britt.
Семейство Salviniaceae (Азолловые) T. Lestib.
Род Salvinia (Сальвиния) Seguier
Вид Salvinia natans (Сальвиния плавающая) (L.) All., 1785

Данный папоротник относится к голарктической области. Ареал довольно широкий, но ограничен зоной полупустынь на юге (Астраханская область РФ) и южной границы лесной зоны, в которой встречается реже [32].

Экологически Salvinia natans выделяется обитанием в мелких пресных, хорошо прогреваемых водоемах. К таким водоемам относятся пойменные и материковые озера, старицы, реки со спокойным течением. Часто встречается в прибрежной зоне [32] S. natans относится к экологической группе гидрофитов – растений, которые свободно плавают на поверхности воды согласно классификации [21].

S. natans образует на поверхности водоемов заросли, ограничивающие доступ такого абиотического фактора как свет. Это ведет к изменению экологических условий в водоеме. S. natans продемонстрировала способность накапливать и, следовательно, удалять более одного тяжелого металла из растворов с несколькими металлами, хотя эффективность поглощения тяжелых металлов варьировалась для каждого металла, присутствующего в разных комбинациях.  Поэтому сальвиния может быть рекомендована в качестве вида для очистки воды, загрязненной тяжелыми металлами. (Dhir, Srivastava 2011)

S. natans является однолетним папоротником, лишенным корней.

Так как объект исследования является водным папоротником, в его строении отображаются соответствующие месту обитания черты.  У S. natans листья, покрытые волосками, расположены мутовчато, что обеспечивает хорошую гидродинамику (рис. 2.1). Характера гетерофиллия [5]. Надводные листья осуществляют фотосинтез, а подводный лист имеет гидростатическую функцию. В мезофилле листа имеются крупные полости – аэрокамеры. Находящийся в них воздух удерживает лист на поверхности воды. В стебле выделяются крупные воздушные полости. Проводящая система представлена сифоностеллой. [29].

волоски на листьях

Рисунок 2.1 – Волоски на плавающих листьях S. natans.

Сорусы прикреплены к подводному листу и делятся на мегасорусы и микросорусы, в которых формируются мега- и микроспорангии соответственно. «В одном узле побега обычно содержится один – два мегасоруса с несколькими десятками мегаспорангиев и несколько микросорусов с несколькими сотнями микроспорангиев. Микроспорангий содержит 64 или 32 микроспоры» [5].

В средней полосе созревание спорангиев происходит в сентябре, что говорит о роли фотопериодизма в размножении S. natans. Высвобождение спор происходит в октябре, и с понижением температуры происходит их вмерзание в лед. Кроме того, споры могут прикрепляться к субстрату, и зимовать вне воды. Эту особенность необходимо учитывать при организации сбора сорусов, так как более ранний сбор спор может привести у некорректным результатам эксперимента по исследованию сохранности и зимовке спор в различных условиях. Для успешной зимовки спор важно учитывать необходимость понижения температуры.

При таянии льда в мае – апреле (возможно и раньше, в зависимости от климатической нормы) происходит прорастание спор на поверхности воды. Из спор развиваются женские и мужские гаметофиты, в которых созревают гаметы.

Прорастание мегаспорангиев начинается с увеличением биологически активных температур; в пределах южной и северной границы ареала – в начале мая, даты могут варьировать от сроков наступления половодья (2, 3, 5].

2.1. Методы исследования

Экспериментальную часть работы проводили в несколько этапов в период 2020-2021 г.

Первый этап: сбор материала для проведения опыта

Спорофиты Salvinia natans собраны в естественных местах произрастания папоротника на территории Астраханской области в Икрянинском и Приволжском районах в трёх ериках: Кигач, Шантемир, Верхний Жилой.  Сбор осуществляли осенью (конец сентября – начало октября), когда сорусы полностью сформированы. Выбирали разветвленные генеративные растения из одной размерной категории, содержащие порядка 40-50 метамеров. Особи перевозили в небольшом количестве воды в пластиковых прозрачных емкостях объемом 1000 мл и диаметром 17 см. (рис.2.2)

емкость для спорофитов

Рисунок 2.2 – Емкость с водой для хранения спорофитов Salvinia natans

После этого материал был перевезен в лабораторные условия в Москве для дальнейшей обработки.

Второй этап: сортировка объектов и закладка опыта

В каждую емкость (объемом 1000 мл и диаметром 17 см) в воду помещали по три растения (по одному с каждого ерика), предварительно составив их схемы и подсчитав количество метамеров на каждом растении. Особи группировали таким образом, чтоб суммарно в каждой емкости оказалось примерно 120 метамеров сальвинии плавающей. Половину емкостей высушили до полностью сухого состояния, в остальные постоянно подливали фильтрованную водопроводную воду. В этот период растения находились при комнатной температуре. Когда все емкости были собраны и подготовлены к опыту (декабрь 2020 года), произвели расстановку их в разные условия зимовки.

Расстановка тазов осуществлялась с учетом разных комбинаций двух абиотических факторов: температуры и обводнённости. Все емкости находились в условиях отсутствия света. В морозильной и холодильной камере для этого с момента постановки опыта не открывали дверь. В комнате емкости поместили под светонепроницаемые ящики, и подливали воду в ночное время. В морозильной и холодильной камерах подлив воды не требовался, емкости были прикрыты крышками. В итоге получилось 6 комбинаций двух абиотических факторов среды, которые представлены в таблице 2.2.

Таблица 2.2 – Условия зимовки в экспериментальных емкостях.

Место зимовки Температура Обводненность Освещение ИНДЕКС УСЛОВИЙ
Морозильная камера -180С Влажно Темно Мор ТВ
Морозильная камера -180С Сухо Темно Мор ТС
Холодильная камера +50С Влажно Темно Хол ТВ
Холодильная камера +50С Сухо Темно Хол ТС
Комната +15+200С Влажно Темно Ком ТВ
Комната +15+200С Сухо Темно Ком ТС
Комната +15+200С Влажно Свет Ком СВ
Комната +15+200С Сухо Свет Ком СС

Каждый вариант опыта имел троекратную повторность. В итоге в эксперименте было задействовано 24 емкости, в каждой по три особи сальвинии плавающей.

Третий этап: наблюдение за динамикой прорастания спор.

Споры S. natans находились в экспериментальных условиях 4 месяца. По прошествии этого времени 11 апреля 2021 года экспериментальные растения поместили в равные условия естественного гидротермического и светового режимов для наблюдения за процессами прорастания спорангиев и развития новых особей.

В качестве критериев успешности зимовки выбрали:

1) дату начала прорастания мегаспорангиев;

2) количество образовавшихся дочерних растений;

3) динамику спектра онтогенетических состояний новых особей (как гаметофитов, так и, в последствии, спорофитов).

Для установления даты прорастания мегаспорангиев ежедневно, начиная с 11 апреля, проводили тщательный осмотр всех мегаспорангиев в емкостях. Факт прорастания состоял в растрескивании щели в стенке мегаспорангия и появлении маленького зеленого бугорка женского гаметофита. Обнаружение хотя бы одного проросшего мегаспорангия отмечали, как дату начала прорастания в конкретной емкости.

С частотой раз в 5 дней емкости фотографировали, а также подсчитывали в них общее количество новых особей. Особи вынимали из емкостей в чашки Петри с водой и под бинокуляром при естественном освещении (чтобы не произошло нарушение морфогенеза растений) определяли онтогенетическое состояние каждой по методике, разработанной Н.С. Барабанщиковой. Спектр онтогенетических состояний вычисляли как процентное соотношение количества особей разных онтогенетических состояний.

Четвертый этап: Обработка полученных данных.

 Далее проводилась статистическая обработка данных (прил. 1 – 8).

Разные варианты опыта и повторности в одном варианте опыта сравнивали между собой по трем вышеописанным критериям.

1. Количество растений в каждом тазу и их онтогенетические состояния оценивались посредством метода описательной статистки «Трехмерный визуальный анализ данных» [12]

Данный метод относится к методам визуализации информации и выполняется при помощи алгоритмов программы MS Excel.

Данный метод позволяет провести визуальный анализ в трехмерном пространстве (рис. 2.2).

Данный позволяет анализировать данные в трехмерном пространстве, то есть, а также производить построение изображения последовательностей наблюдением за объектом для одной или нескольких выбранных переменных:

— ось Y – выбранные переменные (количество особей),

— по оси X – последовательные наблюдения за различными формами;

 – по оси Z откладываются значения переменных (для объектов, за которыми ведется наблюдение).

Трехмерный анализ данных представляет собой диаграмму (гистограмму), которая визуализирует в динамике онтогенетические состояния объекта в разных условиях.

Далее применялся метод элементарной статистической обработки данных в программе Excel «Расчет средней арифметической по ряду данных»:

Формула статистики

,

где xi – значение, описывающее признак,

n – количество значений, описывающих признак;

Данные заносились в сводную таблицу, по результатам которой строился итоговый график, описывающий изменения, происходящих с каждой группой объектов.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По завершении камеральной обработки вышеперечисленными методами, был произведен анализ воздействия стабильных температур на хранение спор S. natans и их последующее воспроизведение.

Анализ проводили путем описания диаграмм, гистограмм и временных шкал полученных в результате проведенной статистической обработки данных.

Для определения характера и степени влияния стабильных температур в сочетании с другими абиотическими факторами на успешность зимовки спор Salvinia natans, нами была построена временная шкала (рис. 3.1), на которой отражено прорастание опытных групп по датам.

Самыми первыми проросла группа ХолТВ (5 мая) и ХолТС и КомТВ (9 мая). Далее прорастали остальные емкости с сочетаниями условий Мор, Ком, оставшиеся емкости Хол. Появление растений фиксировалось в период 25 мая – 14 июня. Последними проросли Хол-ТВ -9 (22 июня), КомТВ-25 и МорТВ-5 (4 июля). Последними проросли споры в емкости ХолТВ-11 (8 июля).

На рис. 3.2 представлена динамика прорастания особей в разных вариантах емкостей.

Рисунок 3. 1 – Временная шкала прорастания особей в разных вариантах емкостей

прорастание разных особоей


 Рисунок 3. 2 – Динамика прорастания особей в разных вариантах емкостей

Наиболее благоприятные условия были для прорастания в ХолТВ и ХолТС. Прорастание особей фиксировалось с 20 мая. Также в данных емкостях насчитывалось максимальное количество особей всех онтогенетических состояний.

Для группы спор, хранившихся при комнатной температуре с различным сочетанием факторов, прорастание наблюдалось с 10 июня. Данные выборки (за исключением КомСС) показали небольшое количество особей и онтогенетических состояний, что говорит о неэффективности хранения спор в данных условиях.

При анализе динамики прорастания спор, хранившихся в морозильной камере, можно отметить, что прорастание фиксировалось, начиная с 10 июня. Количество особей n>100 наблюдалось в МорТС, в МорТВ количество растений единично, что также говорит о меньшей эффективности хранения спор при промораживании.

Таким образом, самую лучшую динамику показали растения, споры которых хранились при стабильных условиях холодильника. При этом зимовка при сухих условиях протекает лучше при вариантах КомСС и МорСС. Это позволяет сказать что  В сухом состоянии S.natans зимует в большее широком диапазоне.

Для оценки воздействия экспериментальных условий зимовки споровой продукции Salvinia natans на развитие нового поколения спорофитов нами была проведена оценка динамики онтогенетического спектра при помощи построения диаграмм.

I. Эффективность хранения спор при комнатной температуре. Вначале рассмотрим результаты наблюдений за емкостями (КомТВ) с растениями, хранившихся в условиях: комнатная температура – темно – влажно (рис. 3.3).

Рисунок 3.3 – Динамика онтогенетических состояний S. natans при сочетании факторов (КомТВ): комнатная температура – темно – вода.

На диаграмме визуализировано, что максимальное количество растений (р) наблюдали 26.06.2021, при этом следует отметить первую волну прорастания 17-23 мая и вторую 21 июня, когда количество растений увеличилось почти вдвое. Однако общее количество растений небольшое (с учетом исходного количества метамеров в тазах). Спектр наиболее разнообразен состояниями 26.06.2021. Из трех повторностей прорастание произошло только в двух, причем одна проба проросла 18 мая, а другая – 2 июля. Однако, позднее прорастание было очень малочисленным (3 особи), поэтому все основные изменения в динамике онтогенетической структуры, по сути, относятся к первой, более рано проросшей пробе.

При анализе сочетания условий хранения спор (КомТС): комнатная температура – темно – сухо, были получены следующие результаты (рис. 3.4).

Рисунок 3.4 – Динамика онтогенетических состояний S. natans при сочетании факторов (КомТС): комнатная температура – темно – сухо

При данном сочетании абиотических факторов максимальное количество растений наблюдается 11.06.2021. Однако их количество небольшое (max 44). В последующие дни наблюдений количество растений (р) также увеличивалось по 26.06.2021 включительно: позже новые растения не наблюдались. Динамика ювенильных форм незначительная при максимальном показателе 4 шт. 26.06.2021 и имматурные формы появляются также 26.06.2021 в количестве n=32. То есть, можно сделать вывод, что стабильная температура +15 градусов при отсутствии света и влаги не является наиболее эффективной для хранения спор и их последующего воспроизведения exsitu в данной группе температурных условий. Спектр наиболее разнообразен состояниями 20.06.2021. Количество особей незначительно.

Анализ сочетания факторов КомСС: комнатная температура – свет – сухо показал следующие результаты (рис. 3.5).

Рисунок 3.5 – Динамика онтогенетических состояний S. natans при сочетании факторов (КомСС): комнатная температура – светло – сухо

Как видно из гистограммы, максимальное количество растений (р) приходится на 02.07.2021 (n=282). Однако прорастание начинается довольно кучно в период 11.06.2021 – 02.07.2021, то есть позже, чем в предыдущих наблюдениях. Количество форм j и im также максимально в данный период наблюдения. Большее количество растений, по сравнению с предыдущим наблюдением, говорит о роли света для прорастания спор в засушливых условиях (количественные данные больше). Данная выборка наиболее эффективная для прорастания при комнатной температуре.

Наблюдение за последней емкостью с температурой +15 градусов (КомСВ), но с присутствием освещенности и влаги, показало следующее (рис. 3.6).

Рисунок 3.6 – Динамика онтогенетических состояний S. natans при сочетании факторов (КомСВ): комнатная температура – светло – влажно

Как видно из гистограммы, максимальное количество растений (р) приходится на 16.06.2021 (4). Новые особи (р) наблюдаются в период с 10.06 – 26.06, однако их количество крайне незначительное. Максимальное количество растений j наблюдается 26.06.21 (n=1), что говорит о неэффективности комнатной температуры для хранения спор. Количество растений im максимально на 02.08.2021 – это самое позднее время наблюдения за появлением данной формы растения, что также подтверждает предположение о том, что хранение спор при комнатной температуре негативно сказывается на воспроизведении S. natans. Исходя из количественных данных, мы можем утверждать, что хранение спор при комнатной температуре неэффективно.

II. Эффективность хранения спор в холодильнике.

При анализе условий ХолТВ были получены следующие результаты (рис. 3.7).

Рисунок 3.7 – Динамика онтогенетических состояний S. natans при сочетании факторов (ХолТВ): холодильник – темно – влажно

Как видно из диаграммы, уже 20.05.2021 появляются первые гаметофиты (n=40). Количество проростков разных форм значительно (max n=804) и наблюдаются, начиная с 25.05.2021. В данном тазу представлены все формы, однако появление разных форм приурочено к разным временным промежуткам. Тем не менее, наличие различных форм растений в данном тазу, равно, как и сроки появления, говорят о положительном воздействии стабильных температур (+5) в условиях холодильника. Также на диаграмме визуализировано, что появление разных форм растений имеет временной разброс, причем появление всех онтогенетических состояний наблюдалось в одной из трех повторяемости (таз 7). В остальных тазах фиксировались единичные особи (таз 11, n=1), в тазу 9 растений не наблюдалось. Тем не менее, таз 7 оказался наиболее эффективным в данной выборки, что дает нам возможность считать сочетание условий: холодильник – темно – влажно эффективным для хранения спор при стабильных низких положительных температурах.

Далее анализировались растения, споры которых зимовали в условиях холодильника в темноте и в высушенном состоянии (ХолТС). Результаты были следующие (рис. 3.8).

Рисунок 3.8 – Динамика онтогенетических состояний S. natans при сочетании факторов (ХолТС): холодильник – темно – сухо

Как видно из диаграммы, уже 20.05.2021 появляются первые гаметофиты (n=40). Количество проростков разных форм значительно (max n=804) и наблюдаются, начиная с 25.05.2021. В данном тазу представлены все формы, однако следует отметить, что появление форм im (n=346) наблюдалось только с 13.06.2021, что говорит о меньшей эффективности хранения в данных условиях, чем в ХолТВ. Из трех повторяемостей наилучшие результаты показал таз 10 ( представлены все онтогенетические состояния) в остальных повторностях также фиксировались особи, однако в меньшем размере (таз 12: n>100), что также говорит об эффективности хранения спор в условиях холодильника и положительного влияния условий хранения на их прорастание.

III. Эффективность хранения спор в морозильной камере.

При анализе условий хранения спор МорТВ были получены следующие результаты (рис. 3.9).

Как видно из гистограммы, после хранения в данном комплексе условий не наблюдаются гаметофиты (n=0). Проростки появляются только 10.06.2021 в крайне малом количестве n=20. Остальные формы растений не наблюдаются вплоть до 26.08.2021, что говорит о неэффективности хранения спор при стабильной температуре -18 градусов.

Рисунок 3.9 – Динамика онтогенетических состояний S. natans при сочетании факторов (МорТВ): морозильная камера – темно – влажно

Из двух повторностей растения были зафиксированы в одной (таз 1), но в крайне малом количестве. В тазу 5 наблюдалось одно растение im, что также говорит о неэффективности хранения спор в условиях промораживания.

Далее была проанализирована всхожесть спор, зимовавших в условиях МорТС (рис. 3.10).

Рисунок 3.10 – Динамика онтогенетических состояний S. natans при сочетании факторов (МорТС): морозильная камера – темно – сухо

Анализ рис. 3.10 показал лучший результат в выборке «промораживание» (n>100), однако сроки появления новых особей более поздние, нежели в предыдущей повторяемости. Таз 6 показал наибольшую эффективность по количеству особей и онтогенетическим состояниям, в тазу 4 наблюдались единичные растения.

ВЫВОДЫ

В ходе данного исследования мы изучили влияние экспериментальных условий хранения спор Salvinia natans (L.) All. в условиях стабильных температур на сроки и качество их прорастания.

В процессе изучения научной и научно-методической литературы нами установлено, что на хранение спор Salvinia natans влияют различные факторы среды. Наибольшее влияние оказывают абиотические факторы, такие, как свет, температура воздуха, влажность. При анализе научной литературы установлено, что для хранения спор Salvinia natans оптимальны не все сочетания абиотических факторов среды.

В связи с этим нами было организовано экспериментальное исследование, результаты которого показали, что различное сочетание абиотических факторов влияет на успешность зимовки спор Salvinia natans.в разной степени.

В результате проведенного исследования можно сделать следующие выводы:

1. Выявлено, что зимовка спор Salvinia natans возможна при всех восьми сочетаниях абиотических факторов, созданных в эксперименте. По количеству новых особей и срокам их появления обнаружено 4 наиболее благоприятных для зимовки спор сочетания факторов: первое место заняли комбинации «стабильные температуры в условиях холодильника (+5) – вода» и «стабильные температуры в условиях холодильника (+50С) – сухо», второе место – «стабильные температуры в условиях комнаты (+15+200С) – свет – сухо» и «стабильные температуры в условиях морозильной камеры(-180С) — сухо».. Наличие или отсутствие света не оказывало существенного влияния на сроки и количество новых растений.  Salvinia natans  выживает во всех вариантах но степень влияния условий зимовки различна. Зимовка во влажных условиях возможна при стабильных температурах холодильника, они в большей степени сходны с естественными условиями зимовки Salvinia natans.  В сухом состоянии она зимует в более широком диапазоне, о чем свидетельствуют показатели прорастания вариантов ХолТС, КомСС и МорТС.

2. На основе анализа динамики изменения спектров онтогенетических состояний новых особей Salvinia natans обнаружено, что наиболее оптимальными являются условия с охлаждением (Хол:+50С) и промораживания (Мор:-180С) для хранения спор и последующего воспроизведения. При хранении спор в условиях комнатной температуры не наблюдается эффективного прорастания спор и появление растений различных онтогенетических состояний.

3. Разработана методическая глава, направленная на изучение возможности применения Salvinia natans в школьном курсе биологии во время лабораторных работ. Была разработана лабораторная работа с применением сальвинии при изучении плазмолиза. Также были разработаны задания формата ЕГЭ.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Данные для КомТВ

Дата просмотра 17.5.21   23.5.21   28.5.21 1.6.21 11.6.21 21.6.21 23.6.21 26.6.21 2.7.21 31.7.21
Г 3 0   0 0 0 0 0 0 0 0
Га                      
Гб 3                    
Р 13 25   16 15 4 19 17 16 28 0
P0 1 4             1 6  
P1 9     1     8   2 4  
P2 3 4   7 8   9 15 2 13  
P3   15   6 4 3 1 2 5 5  
P4   2   2 3 1 1   6    
P-J       4 5 4 9 5 9 1  
J       10 13 8   5 2    
J-Im         1 4     5    
Im           17 36 36 39   1
Im-V                      
V                      
Всего   25   30 34 37 64 63 71 29 1


ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Данные для КомТС

Дата просмотра 1.6.21 11.6.21 20.6.21 26.6.21 1.6.21 11.6.21 16.6.21 26.6.21 11.6.21 16.6.21 26.6.21
Г 0 0 0 0 0 0 2 2 0 0 0
Га                      
Гб             2 2      
Р 0 44 5 20 0 30 8 15 0 0 0
P0       7     1 4      
P1       2       1      
P2   11   9   7 4 3      
P3   29 4 2   22 2 7      
P4   4 1     1 1        
P-J     2 1   2 19 4 1    
J     8       8 1      
J-Im     17 1     1 4   1  
Im     11 32       18      
Im-V                      
V                      
Всего: 0 44 43 54 0 32 38 44 1 1 0

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

Данные для КомСВ

Дата просмотра 11.6.21 16.6.21 26.6.21 2.8.21 12.6.21 20.6.21 26.6.21 2.8.21
Г 0 0 0 0 0 0 0 0
Га                
Гб                
Р 2 4 0 0 1 1 2 0
P0                
P1           1 1  
P2 1 3     1   1  
P3 1 1            
P4                
P-J     2       1  
J     1          
J-Im                
Im       3     1 11
Im-V                
V                
Всего 2 4 3 3 1 1 4 11

ПРИЛОЖЕНИЕ 4

Данные для КомСС

Дата просмотра 11.6.21 16.6.21 26.6.21 31.7.21 11.6.21 16.6.21 26.6.21 2.8.21
Г 0 0 0 0 0 0 0 0
Га                
Гб                
P 5 0 0 0 0 0 0 0
P0                
P1                
P2 1              
P3 4              
P4                
P-J 3 5     2      
J 1         1    
J-Im   3       1    
Im   1 9 3     2 2
Im-V                
V                
Всего: 9 9 9 3 2 2 2 2

ПРИЛОЖЕНИЕ 5

Данные для ХолТВ

Дата просмотра 20.5.21 24.5.21 28.5.21 13.6.21 17.6.21 22.6.21 28.6.21 2.7.21 20.5.21 28.5.21 26.8.21
Г 22 0 80 0 0 0 0 0 0 0 0
Га 21   40                
Гб 1   40                
Р 28 0 514 804 406 98 22 0 0 0 0
P0 2   154                
P1 1   215                
P2 23   129                
P3 2   14                
P4     2                
P-J     10 84 192 46 11        
J     3 8 79 62 5 11      
J-Im       2 43 169 98 38      
Im         13 232 194 146     1
Im-V                      
V                      
Всего: 50 0 607 898 733 607 330 195 0 0 1

ПРИЛОЖЕНИЕ 6

Данные для ХолТС

Дата просмотра 20.5.21 24.5.21 29.5.21 13.6.21 2.7.21 6.7.21 13.6.21 17.6.21 28.6.21 13.6.21 28.6.21 2.7.21
Г 15 16 11 0 0 0 0 0 0 2 2 0
Га 10 4 7             1    
Гб 5 12 4             1 2  
P 55 123 274 124 10 0 7 1 8 81 53 0
P0 8 56 54   1           5  
P1 3 21 42   2       2 4 11  
P2 15 4 159   1   4   6 64 33  
P3 29 23 18   4   3 1   10 3  
P4   19 1   2         3 1  
P-J   3 13 206 6     6 5 9 10  
J     29 10 1     1 1   4  
J-Im     1 15 1 2         3 2
Im       33 395 346     6   100 326
Im-V                        
V                        
Всего: 70 142 328 388 413 348 7 8 20 92 172 328

ПРИЛОЖЕНИЕ 7

Данные для МорТВ

Дата просмотра 10.6.21 13.6.21 17.6.21 28.6.21 2.7.21 31.7.21 26.8.21
Г 0 0 0 0 0 0 0
Га              
Гб              
Р 2 2 0 0 1 0 0
P0              
P1              
P2 1            
P3 1 1     1    
P4   1          
P-J     1        
J     1        
J-Im     2        
Im       3   2 1
Im-V              
V              
Всего: 2 2 4 3 1 2 1

ПРИЛОЖЕНИЕ 8

Данные для МорТС

Дата просмотра 29.5.21 13.6.21 6.7.21 10.6.21 13.6.21 17.6.21 28.6.21 26.8.21
Г 0 0 0 0 0 0 0 0
Га                
Гб                
Р 0 140 112 3 5 1 0 0
P0     1          
P1   3 4          
P2   38 40 1 1      
P3   47 51 2 2 1    
P4   52 16   2      
P-J   114 52   1 3    
J   4 26     2    
J-Im   1 4     1    
Im     56       7 4
Im-V                
V                
Всего: 0 259 250 3 6 7 7 4

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *